如何测定烈性噬菌体的一步生长曲线

烈性噬菌体一步生长曲线为什么一开始就是100~

烈性噬菌体一步生长曲线为什么一开始
1. Ct值出现过晚（Ct>38）

扩增效率低: 反应条件不够优化。设计更好的引物或探针；改用三步法进行反应；适当降低退火温度；增加镁离子浓度等。

PCR各种反应成分的降解或加样量的不足。

PCR产物太长: 一般采用80-150bp的产物长度。

2. 标准曲线线性关系不佳

加样存在误差: 使得标准品不呈梯度。

标准品出现降解: 应避免标准品反复冻融，或重新制备并稀释标准品。

引物或探针不佳: 重新设计更好的引物和探针。

模板中存在抑制物，或模板浓度过高

潜伏期
指噬菌体的核酸侵入宿主细胞以后至第一个成熟噬菌体粒子装配前的一段时间。它又可以分为两个阶段:
1、隐晦期:指在潜伏期前期人为地(用氯仿等)裂解宿主细胞以后，此裂解液仍无侵染性的一段时间，这时细胞正处于复制噬菌体核酸和合成蛋白质衣壳的阶段;
2、胞内累积期:即潜伏期的后期，指在隐晦期后，若人为地裂解细胞，其裂解液已呈现侵染性的一段时间，这意味着细胞内已经开始装配噬菌体粒子，此时电镜可以观察到。
裂解期
紧接在潜伏期后的宿主细胞迅速裂解、溶液中噬菌体粒子急速增加的一个阶段。噬菌体或者其它病毒粒因只有个体装配而不能存在个体生长，再加上若宿主细胞裂解的突发性，因此，从理论上来说，其裂解是瞬间出现的。但是事实上因为宿主群体中各个细胞的裂解不可能是同步的，故出现较长的裂解期。
平稳期
指感染后的宿主细胞已经全部裂解，溶液中噬菌体的数目达到最高峰，在这个时期，每一个宿主细胞释放的平均噬菌体粒子数即为裂解量。

一步生长曲线
定量描述毒性噬菌体生长规律的实验曲线称为一步生长曲线。是研究病毒复制的一个实验，最初为研究噬菌体复制而建立，现已推广到动物病毒及植物病毒复制的研究中。具体操作是将适量病毒接种于高浓度敏感细胞培养物，或高倍稀释病毒细胞培养物，或以抗毒血清处理病毒细胞培养物以建立同步感染，以感染时间为横坐标，病毒的效价为纵坐标绘制出的病毒特征曲线，即为一步生长曲线。一步生长曲线分为潜伏期、裂解期和平稳期。
一步生长曲线不同阶段。
潜伏期：
指噬菌体的核酸侵入宿主细胞以后至第一个成熟噬菌体粒子
装配前的一段时间。它又可以分为两个阶段：
1、隐晦期：指在潜伏期前期认为的（用氯仿等）裂解宿主细胞以后，此裂解液仍无侵性的一段时间，这时细胞正处于复制噬菌体核酸和合成蛋白质衣壳的阶段；
2、胞内累积期：即潜伏期的后期，指在隐晦期后，若认为的裂解细胞，其裂解液已呈侵染性的一段时间，这意味着细胞内已经开始装配噬菌体粒子，此时电镜可以观察到。
裂解期：
紧接在潜伏期后的宿主细胞迅速裂解、溶液中噬菌体粒子急
速增加的一个阶段。噬菌体或者其它病毒粒因只有个体装配而不能存在个体生长，再加上若宿主细胞裂解的突发性，因此，从理论上来说，其裂解是瞬间出现的。但是事实上因为宿主群体中各个细胞的裂解不可能是同步的，故出现较长的裂解期。
平稳期：
指感染后的宿主细胞已经全部裂解，溶液中噬菌体的数目达
到最高峰，在这个时期，每一个宿主细胞释放的平均噬菌体粒子数即为裂
解量。
实验方法
一步生长曲线的实验方法如下：先把在对数期生长的敏感细菌悬浮液与适量的噬菌体混合，通常噬菌体和细菌的混合比例为1:10，避免几个噬菌体同时侵染一个细菌细胞。经数分钟吸附后，混合液中加入一定量的该噬菌体的抗血清，以中和尚未吸附的噬菌体。然后再用培养液进行高倍稀释，以免发生第二次吸附和感染。培养后定时取样，将含噬菌体的样品与敏感细菌混合，在平板上培养，计算噬菌斑数。结果可见，在吸附后的开始一段时间内（5～10min），噬菌斑数不见增加，说明噬菌体尚未完成复制和组装，这段时间称为噬菌体的潜伏期。紧接着在潜伏期后的一段时间（感染后20～30min），平板中的噬菌斑数突然直线上升，表示噬菌体已从寄主细胞中裂解释放出来，这段时间称为裂解期。每个被感染的细菌释放新的噬菌体的平均数称为裂解量。当宿主全部裂解，溶液中的噬菌体的效价达到最高点时称为平稳期。
结论
通过一步生长曲线可以得出病毒的潜伏期和裂解量。潜伏期是毒粒吸
附细胞受到感染细胞释放出子代毒粒所需的最短时间。裂解量是每个受染
细胞所产生的子代病毒颗粒的平均数目，其值等于稳定期受染细胞所释放
的全部子代病毒数目除以潜伏期受染细胞的数目，即等于稳定期病毒效价
与潜伏期病毒效价之比。single burst curve 定量描述烈性噬菌体生长规律的实验曲线
。其基本步骤是用噬菌体的稀悬液感染高浓度的宿主细胞，以保证每个细胞
至多不超过一个噬菌体吸附。数分钟后中止吸附并稀释后置于该细菌最适生长温度下培养。在一定时间内，每隔数分钟取样作效价测定。以效价为纵坐标，培养时间为横坐标所绘成的曲线即为一步生长曲线，它可以反映每种噬菌体的三个最重要的特性参数：潜伏期、裂解期、裂解量。
双层平板法
又叫双层琼脂平板法
先在培养皿中倒入底层固体培养基，凝固后再倒入含有宿主细菌和一定
稀释度噬菌体的半固体培养基。培养一段时间后，计算噬菌斑的数量。
方法:
双层琼脂平板法
1、 倒下层琼脂融化下层培养基，倒平板（约10mL/皿）待用。
2 、倒上层琼脂融化上层培养基，待融化的上层培养基冷却至50℃左右时，每管中加入敏感指示菌 (大肠杆菌) 菌液0.2mL，待检样品液或上述噬菌体增殖液0.2～0.5mL，混合后立即倒入上层平板铺平。
3、 恒温培养
30℃恒温培养6～12h观察结果。
4 、观察结果
如有噬菌体，则在双层培养基的上层出现透亮无菌圆形空斑——噬菌斑。

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