分子标记

什么是分子标记？~

长期以来，植物育种中选择都是基于植株的表型性状进行的，当性状的遗传基础较为简单或即使较为复杂但表现加性基因遗传效应时，表型选择是有效的。但许多重要农艺性状为数量性状，如产量等；或多基因控制的质量性状，如抗性等；或表型难以准确鉴定的性状，如根系活力等，此时根据表型提供的对性状遗传潜力的度量是不确切的，因而选择是低效的。
遗传育种家们很早就提出了利用标记进行辅助选择以加速育种改良进程的设想。形态学标记等常规遗传标记是最早用于植物育种辅助选择的标记，但由于它们数量少、遗传稳定性差，且常常与不良性状连锁，因而利用受到很大限制。近十年来，分子生物学技术的发展为植物育种提供了一种基于DNA变异的新型遗传标记——DNA分子标记，或简称分子标记。
与传统应用的常规遗传标记相比，分子标记具有许多明显的优点，因而已被广泛应用于现代作物遗传育种研究的各个方面，正在为植物育种技术带来一场新的变革。

分子标记是生物遗传标记的一种。通过引物设计的不同，用PCR的方法在生物的基因组DNA上扩增出相关条带，通过电泳、软件识别、分析，可用作生物遗传信息的研究。
分子标记种类有很多，第一代分子标记以RFLP为代表，是基于酶切位点的多态性开发的分子标记。
第二代分子标记以SSR为代表，是基于简单重复序列的多态性。第二代分子标记通过引物的特殊设计，能够扩增DNA上的相应位置的序列，根据它们的多态性，进行下一步分析。
第三代分子标记以SNP为代表，单核苷酸多态性。是基于高通量测序为基础的新一代分子标记技术。

分子标记
在农业基础与应用研究领域，分子标记技术已开始应用于作物种质资源和育种的研究，特别是在构建分子遗传图谱和标记目的性状基因方面取得了很大的进展。

形态标记（morphologica markers）即植物的外部特征特性，如株高、穗长、粒色、千粒重等。此种形态标记简单直观，但是形态标记数少、多态性差、易受环境条件影响。在小麦抗叶锈病基因标记方面，SINGH[5]曾利用形态标记发现慢叶锈基因Lr34和小麦叶片尖部坏死基因紧密连锁。

细胞标记（cytological markers）主要是染色体核型（染色体鼠数目、大小、随体、着丝点位置等)和带型(C带、N带、G带等)，这类标记的缺点是数目有限。目前，还未发现用其进行小麦抗叶锈基因的标记。

生化标记(biochemical markers)主要包括同工酶和储藏蛋白。生化标记具有经济方便的优点，但其标记数有限。DAVlD[6]等曾利用生化标记内肽酶同工酶EP-Dld作为遗传标记对以Thatcher为背景的小麦抗叶锈病近等基因系进行连锁分析，发现EP-Dld与Lr19紧密连锁，重组值为(0.01士0.09)个作图单位。WINZELER[7]等利用含Lr19的小麦抗叶锈病近等基因系，发现生化标记内肽酶同工酶EP-Dl的无效等位基因EP-Dlc可以作为与 Lr19紧密连锁的生化标记，遗传距离为(0.33士0.33)cM。

分子标记与形态标记、细胞标记、生化标记相比较，有以下几方面的优点:①在植物体的多个组织及生育阶段均可检测到，不受时空限制。②数量多，遍及整个基因组。③有许多标记表现为共显性，能够鉴别基因型纯合与否，提供完整的基因型。在标记小麦抗叶锈病基因方面，分子标记可以在更深层次上揭示小麦抗锈遗传机制。通过找到与抗锈基因紧密连锁的分子标记，不但能在遗传背景不同的育种材料中特异性的检测目的基因，而且可以在任一生育阶段同时对多个抗性基因进行筛选，这为了解抗源和抗病品种中所含有的抗性基因提供了更为迅速、稳定、可靠的方法。

目前，用于标记小麦抗叶锈病基因的分子标记主要有以下几种:

2.l RFLP技术在小麦抗叶锈病基因标记中的应用

RFLP(restriction fragment length polymorphism)作为遗传分析的工具开始于1974年，80年代开始应用于植物。其基本原理是物种的基因组DNA在限制性内切酶的作用下，产生相当多的、大小不等的DNA片段，用放射性同位素标记的DNA做探针把与被标记DNA相关的片段检测出来，从而构建出多态性图谱;它所代表的是基因组 DNA在限制性内切酶消化后产生的片段在长度上的差异。RFLP技术被广泛应用于小麦遗传图谱的构建标记和定位小麦的目的基因。

在小麦抗叶锈病基因的RFLP标记方面，SCHACHERMAYR等[8]将一编码受体蛋白激酶的Lrkl0基因的3.9Kb的HindⅢ片段用 PstⅠ分成六个亚片段，将这些亚片段作为RFLP标记，寻找到了特异的Lrk10片段可作为与小麦抗叶锈病基因Lr10紧密连锁的分子标记，将这一亚片段与已知抗性基因的单基因系进行Southern杂交，发现这一3.9Kb的HindⅢ片段仅存在于携带抗叶锈病基因Lr10的近等基因系中。进一步将此 RFLP标记Krkl0-6转变为STS标记STSLrkl0一6，发现一282bp的片段仅存在于携带Lr10的品种中，F2群体分离进一步证明此 282bp的片段与Lr10紧密连锁。SCHACHERMAYR等[9]利用近等基因系找到了与抗叶锈病基因Lr24紧密连锁的RFLP和RAPD的标记。在供试的115个RFLP探针中，其中6个与Lr24紧密连锁，从360个随机RAPD引物中，找到了11个能够揭示多态性的引物，其中一个与 Lr24紧密连锁，并将该RAPD产物克隆、测序将其转化为更为稳定可靠的STS标记，为分子标记辅助育种打下了良好的基础。FEUILLET等[10] 利用小麦抗叶锈病近等基因系Lr1/6*Thatcher和Thatcher及感病品种Frisal，通过F2群体分离，将37个RFLP中的16个定位在了第五部分同源群，而且能在Lr1/6*Thatcher和Frisal之间揭示多态性，I1个RFLP探针能在近等基因系间揭示多态性，F2群体分离分析发现，其中3个与抗性基因连锁，其中一定位在染色体5D上的探针pTAG621证明与Lr1紧密连锁，并将这一RFLP标记转化为了更为可靠的STS 标记。

AUTRIQUE[11]等利用4种含不同抗性基因的小麦近等基因系，根据抗性基因在其染色体上所处的位置选择克隆，同时，从大麦的RFLP连锁图谱和D一基因组RFLP图谱中，挑选了其它的克隆。通过杂交的方法来寻找多态性分子标记。结果发现，定位在染色体7DL和3DL上的8个分子标记，与抗性基因Lr19和Lr24共分离;来自Aegilops umbellulata的Lr9，被定位在染色体6B上，一克隆XksuD27与Lr9共分离，以及与Lr32紧密连锁的两个RFLP标记，遗传距离分别为(3.3土2.6)cM和(6.9土3.6)cM。

2.2 小麦抗叶锈病基因的RAPD标记

NAIK等[12]利用含Lr28的抗叶锈病近等基因系，从80个随机引物中找到了一个能在供体亲本和轮回亲本中揭示多态性的RAPD标记OPJ一 O1。将此387bp的多态性产物克隆、测序，将其设计成更为稳定的STS标记，利用BSA法，对F3群体进行分析，发现387bp的特异性产物只出现在抗性群体中，而在感病群体中表现缺失。证明了RAPD标记OPJ一O1和STS 标记均与Lr28紧密连锁。SIELDLER等[13]利用400个随机引物和14个DNA探针筛选近等基因系Lr9的多态性，并通过F2群体进行遗传连锁分析。结果表明2个RAPD标记和一个RFLP标记可以区分抗感品系,且与Lr9紧密连锁。WILLIAM等[14]利用RAPD技术，从400个随机引物中，找到了3个能在抗病群体和感病群体中揭示多态性的引物0PG-05、0P1-16和OPR-03，将其克隆转化成探针后，对重组群体进行 Southern杂交，确定其中前两个探针与持久抗叶锈病基因相关的数量性状位点(QTL)紧密连锁，其中定位在7BL上的QTL与抗叶锈病基因Lr34 部分同源。SCHACHERMAYR等[15]从395个随机引物中筛选出了3个与小麦抗叶锈病基因Lr9连锁的RAPD标记，将其特异性产物克隆、测序，然后转化成更为稳定的STS标记，F2、F3分离群体检测发现，所有的3个RAPD标记0PA-07、0PJ-l3、OPR-15和一RFLP标记 cMWG684与Lr9紧密连锁。另一RFLP标记PSR546也与Lr9紧密连锁，并与上述四个

DNA标记紧密连锁，遗传距离为(8士2.4)cM，此标记被定位在小麦染色体长臂6BL上。DEDRYVER等[16]利用含Lr24的小麦抗叶锈病近等基因系，在125个随机引物中，只有引物OP-H5能在抗病亲本RL6064中扩

增出一700bp的特异性的条带，而在感病亲本Thatcher中没有。F2群体分离证明，该标记与Lr24完全连锁。将其转变成稳定、可靠的SCAR标记，为分子标记辅助育种提供了有力的工具。

3 其它分子标记

虽然RFLP和RAPD是两种比较普遍的分子标记，但RFLP在小麦中检测的多态性较低，仅为20%--38%。RAPD是方便经济的分子标记，但是重复性和稳定性较差。其它的分子标记，如SSR、ISSR和AFLP的综合信息量大，在作物特别是小麦遗传资源的研究上有着广阔的应用前景。

4 分子标记辅助选择

目前，分子标记技术已开始应用于育种实践，并表现出其独特的优越性。寻找与重要的农艺性状紧密连锁的分子标记，是进行分子标记辅助选择(又称分子育种)和通过作图克隆基因的基础。分子标记辅助选择(Molecular-assisted-selection简称MAS)是生物技术与传统遗传育种相结合而形成的，它可以减少传统的回交育种过程中很难消除的连锁累赘，还可以把不同抗叶锈病基因聚合到同一优良品种中，实现同效基因的累加作用，获得持久抗性。在获得稳定的分子标记的基础上，通过染色体步行(Chromosome walking)等方法分离克隆该基因。

由于分子标记育种技术目前尚不成熟和完善，因此还不能作为一种育种方法单独使用。我国传统育种经验丰富，因此，应注意将分子标记这一先进技术与育种家的丰富经验相结合，使分子标记辅助选择发挥其更大的作用。

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