植物组织培养怎样进行技术操作？

植物组织培养技术在我国农业生产中的应用~

1、快速繁殖优良种苗
用组织培养的方法进行快速繁殖是生产上最有潜力的应用，包括花卉和观赏植物，其次是蔬菜、果树、大田作物及其它经济作物。快繁技术不受季节等条件的限制，生长周期短，而且能使不能或很难繁殖的植物进行增殖。
2、无病毒苗(Virus free)的培养
几乎所有植物都遭受到病毒病不同程度的危害，有的种类甚至同时受到数种病毒病的危害，尤其是很多园艺植物靠无性方法来增殖，若蒙受病毒病，代代相传，越染越重。
自从Morel(1952)发现采用微茎尖培养的方法可得到无病毒苗后，微茎尖培养就成为解决病毒病危害的重要途径之一。若再与热处理相结合，则可提高脱毒培养的效果。对于木本植物，茎尖培养得到的植株难以发根生长，则可采用茎尖微体嫁接的方法来培育无病毒苗。
3、在育种上的应用
植物组织培养技术为育种提供了许多手段和方法，使育种工作在新的条件下更有效的进行。如用花药培养单倍体植株；用原生质体进行体细胞杂交和基因转移；用子房、胚和胚珠完成胚的试管发育和试管受精等 ；种质资源的保存等等。
4、工厂化育苗
近年来，组培苗工厂化生产已作为一种新兴技术和生产手段，在园艺植物的生产领域蓬勃发展。

扩展资料
组织培养除了在农业上的应用外，21世纪初世界各国都在重视另一个方面，即有用化合物的工业化生产。有用化合物包括药物、橡胶、香精油、色素等。这些化合物许多都是高等植物的次生代谢物，有些化合物还不能大规模地人工合成，而靠植物产生这些化合物来源有限。
因此，利用组织培养方法，培养植物的某些器官或愈伤组织，并筛选出高产、高合成能力、生长快的细胞株系，以进行工业化生产，是一条行之有效的途径。
参考资料：新华网-什么是植物组织培养技术？它有何优势？

组培室标准操作程序





一 生产环境



1 工作人员进入组培室必须穿工作服，包括更换拖鞋、穿白大褂，接种人员还要带帽、带口罩。

2 所有人员在组培室内不准高声喧哗、打闹。

3 工作期间，各生产房间要关闭房门，尤其是接种间；工作人员出入要随手关门。

4 各种生产用品要安固定的位置排放整齐，不可乱拿乱放。

5 工作过程中所产生的垃圾要及时清理，尤其是接种间，其内垃圾停留时间不得超过4小时。



二 接种程序



1. 准备工作：接种人员在正式接种之前要做好准备工作，包括准备酒精灯、新洁尔灭、灭菌用脱脂棉以及准备接种工具、分取培养基、接种用苗和工作台灭菌等。

·酒精灯用工业酒精作燃料，而非75%酒精。

·工作台上用的新洁尔灭浓度是0.1%，而非0.01%。

·工作台灭菌包括两步：一是上台前用紫外灯照射30分钟，二是正式接种前再用新洁尔灭仔细擦一遍。

·培养皿的取放：从布包里取培养皿时，一定要注意，手不能接触培养皿的边沿，同时要尽可能减少与培养皿的接触面，一般规定只能用双手的拇指和食指取放。

·接种工具灭菌也分两步，一是用灭菌布包裹好，在高压锅里灭一次，这一步由灭菌人员负责完成；二是在工作台上，从布包里取出后，先用酒精擦拭一下，再放在酒精灯火焰上灼烤一遍，其要求是工具的每一点在火焰上灼烤时间不得少于5秒钟。在工具灭菌之前，工作人员的手部，包括手腕，都要用酒精仔细擦拭一遍。

2 接（转）苗：包括取苗、切苗和接苗三步。

·取苗：先解开培养瓶的瓶盖（封口膜），如果不能一次取出其内的全部材料，要先把封口膜（瓶盖）口对者风源放在酒精灯的左前方，然后把瓶口在酒精灯上烤7～10秒；正式取苗时，瓶口不要斜向外；一次取苗不可太多，以免风干。

·切苗：培养皿放在离风窗10～20厘米处，不可太往外；镊子和手术刀都不可太热，最好是凉的，且在操作过程中，刀和镊都要培养皿斜上方操作，不可在其正上方操作；在切苗过程中产生的垃圾可堆放在培养皿内的一侧位置上，若非迫不得已，不可弄到培养皿外。

·接苗：培养瓶盖（或封口膜）的放置方法和及瓶口灼烤方法与取苗时的相同，烤完瓶口后，要先倒掉瓶内多余的水分，然后在接苗；接苗时，镊子最好不要与瓶口接触，一瓶内一般接5～6棵苗，不要放得太多；组培苗在瓶内要排放均匀、整齐、美观。

·封口、记录：封口膜要及时捆绑，其松紧度以用手转不动为准；下台前要把品种代号、培养基类型、个人编号以及接种日期标示到瓶上。离开之前还要把工作台收拾干净，把接种过程中产生的垃圾清理掉，台上的物品也要摆放整齐。



三 组培苗的管理



1.瓶苗要整齐的摆放在自己的组培架上，不可乱放。

2.接种人员每天都要统计自己的接种数量，包括转前瓶数和转后瓶数。

3.值日人员要定时开灯、关灯，保证组培苗有足够的光照时间，但也不可过长，以每天14小时左右为宜。



四 接种用具的清洗



1.洗刷培养瓶、培养皿：第一步：把培养瓶培养皿放入洗洁净溶液里，先用毛刷清洗内部，再用钢丝球把外面的字清洗掉。第二步：把他们再用清水冲洗3-5遍。第三步：把瓶内的积水倒掉，倒放在准备台，准备台上要先放一层纱布。这一步的清洁标准是：凉干的瓶壁（器皿）内外无明显的斑点、污迹。

2.洗涮镊子：用洗洁精浸泡五分钟，用钢丝球打磨一下然后放入清水冲洗三遍。

五 灭菌



1.对污染苗灭菌：一经发现就随即灭菌处理，大量的进行高压灭菌，少量的加入工业酒精在室外进行处理。

2.室内空气灭菌：每四周用高锰酸钾和甲醛对室内空气灭一次菌。

3.室内地面：每2－3天用新洁尔灭拖一遍地。

4.卧式和手提式高压灭菌锅使用程序：严格按使用说明书操作。

1.玻璃器皿的洗涤：

各种玻璃器皿均应先用洗衣粉洗净后，清水冲洗干净，放入洗液中浸24小时后用清洁水冲洗干净，再经蒸馏水冲洗一次，然后放入烘箱中烘干备用。

洗液的配制：一般采用重铬酸钾50克，加入蒸馏水10毫升，加温溶化，冷却后再缓缓注入90毫升工业硫酸。

2.培养基的制备：

（1）培养基的组成：主要成分包括各种无机盐（大量元素和微量元素）、有机化合物（蔗糖、维生素类、氨基酸、核酸或其他水解物等）、螯合剂（EDTA）和植物激素。固体培养基还应加入琼脂使培养基固化。

经常使用的培养基，可先将各种药品配成10倍或100倍的母液，放入冰箱中保存，用时再按比例取用。

①大量元素：将药品称取之后，分别溶解再依顺序混合定溶，配成10倍浓度的母液，每配制1毫升培养基时取母液100毫升。

②微量元素：微量元素用量少，为精确、方便称取，常配成100倍或1000倍的母液。每配制1毫升培养基时取母液10毫升或1毫升。

③有机化合物类，同微量元素一样，可配成100倍或1000倍的母液，使用时每1毫升培养基中取用10毫升或1毫升。

④铁盐（螯合剂）：铁盐是单独配制的，由硫酸亚铁5.57克和乙二铵四乙酸二钠7.45克，溶于1毫升水中配成，每配制1毫升培养基取用5毫升。

⑤植物激素：一般将植物激素配制成0.1～0.5毫克/毫升的溶液。由于植物激素多数难溶于水，可采用以下方法：

萘乙酸（NAA）：可溶于热水中或先溶于少量95%酒精中，再加水至一定浓度。

吲哚丁酸（IBA）：先用少量0.4%的NaOH溶液溶解，再加水到一定浓度。

吲哚乙酸（IAA）：先溶于少量95%酒精中，再加水到一定浓度。

2，4-D先用少量3.65%的HCl溶液溶解，再加水到一定浓度。

细胞分裂素：6-苄基嘌呤（6-BA）、激动素（KJ）需用3.65%的HCl或0.4%NaOH溶液先溶解后，再加水到一定浓度。

以上所配制的各种母液或单独配制的各种药液，均应放入2～4℃冰箱中保存，以防变质或微生物的污染。培养基中的蔗糖和琼脂，可依需要量随用随称取。

（2）培养基的配方：植物组织培养成功与否，在一定程度上决定于培养基的选择。不同培养基由于所含无机盐的量不同，其实验材料的反应也有差异。植物组织培养常用的培养基为MS培养基。铁盐的使用，除允许培养基用柠檬酸铁10毫克/毫升外，其余培养基都用铁盐母液5毫克/毫升。

表6-13常用培养基营养成分（单位：毫克/千克）

常用培养基营养成分（单位：毫克/千克）（续）-1

（3）培养基的制备程序：配置培养基时，首先按需要量依次吸取各种药液，混合在一起。将蔗糖放入溶化的琼脂中溶解，然后注入混合液，搅拌均匀后用0.4%的NaOH或3.65%的HCl溶液调节pH，再分装于三角瓶等培养容器内，用锡薄纸、羊皮纸等将容器口封紧包好。最后将分装后的培养基，放入高压灭菌锅中灭菌，一般采用1.1千克/厘米压力消毒灭菌15～20分钟，取出冷却凝固后备用。不同培养基在灭菌前应做好标记，防止混乱。

培养基的制作程度

3.接种：

常用消毒剂效果比较

为了得到无菌材料，在接种前必须先对植物材料进行消毒。一般采用化学试剂进行表面消毒。试剂选择及处理时间的长短，依植物材料对试剂的敏感性来决定，并且要选用消毒后容易除去的药剂，防止产生药害，影响愈合组织的发生。常用的消毒药剂有漂白粉（次氯酸钙）、安替福民（次氯酸钠），升汞等（表6-14）。在材料放入消毒剂之前，先用自来水冲洗或先在70%酒精中漂洗一下，有利于消毒剂渗入植物材料并杀死微生物，放入消毒剂消毒后，必须用无菌水认真冲洗几次，再进行接种。由于植物种类及所选用的植物器官或植物组织不同，在消毒顺序和消毒时间上也各不同。

接种用的植物材料（外植体）的大小和形状没有严格限制，但不能太小，过小细胞分裂难以发生。因此，一般要求切块的大小要适当。接种的全过程都应在无菌条件下进行。目前都是在超净工作台上完成，将植物材料接入培养基中即可。

4.培养：

植物组织培养和栽培植物一样，也受温度、光照、培养基的pH等各种环境条件的影响，培养中应严格控制培养室的条件。由于植物的种类，所取植物材料部位等的不同，所要求的环境条件也有差异。一般培养室保持在25±2℃的恒温条件，低于15℃培养物的生长停滞，高于35℃时对生长不利；光照强度为2000勒克斯，光照时间为10～12小时；对培养室内的湿度，一般不加控制，因装有培养基的容器内的湿度基本上能满足要求，外界环境的湿度过高容易造成污染；组培中培养基的pH通常为5.5～6.5。pH在4.0以下，7.0以上对生长都不利。培养不同的植物，选用不同的培养基所要求的pH也不同。

植物组织培养能否成功，选择适合的培养基极为重要。愈合组织的生长、分化和生根，又取决于培养基中激动素和生长素的含量，过高过低都不利于生长。

组培成苗的顺序为：

5.移栽：

组培幼苗移栽成活，是获得大批组培苗的最后一个重要环节，常因移栽不当而遭到损失。通常试管苗具有3～5条根后即可移栽。但长期在瓶内无菌条件下培养的小苗，直接移到室外，必须经过一个过度阶段。移栽前可将试管苗先打开，放在与培养条件相近的光照充足处，锻炼3～5天，使其适应环境后再移栽。移栽时用清水洗去根上的琼脂再栽入盆中，栽植土可选用通气好的粗砂、蛭石、珍珠岩均可，为保持温度，可用塑料薄膜覆盖，这样在室内保持10～30天，就可移至大田正常生长。由组培苗改为盆栽苗又是组培育苗成败的关键之一，因此，应控制好温度、湿度及光照。各种植物对环境条件的要求不同，应区别对待。

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